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              慢病毒包装与感染细胞流程

              2018-03-22  迷途中小...

              在慢病毒感染细胞实验原理与实用流程(一)中,我们学习?#27515;?#29992;目的基因包装成慢病毒感染细胞的原理,今天就和医学方小编学习具体如何操作。

              质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒(病毒包装)

              293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40T抗原的人肾上皮细胞系 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。

              脂质体:某些细胞?#25163;?#30340;天然脂质小体,可作为生物膜,用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞,经同细胞融合而释放。

              小编将以293T细胞包装慢病毒,感染10cm SW480结肠癌细胞为例:

              DAY1

              转染前一天,用1ml胰酶消化293T细胞1-2分钟,用含10% FBS DMEM培养基重悬293T细胞,铺2-3*106个细胞至 10cm dish(70-80% 融合度)(注:慢病毒包装时要多种一点儿293T细胞,慢病毒对细胞的毒性较大!

              DAY2

              (转染时准备无双抗完全培养基,抗生素对转染中细胞损伤大)

              1、转染293T细胞(10cm dish)

              A:470ul optimem稀释30ul Fugene 9(其他转染?#32422;?#27604;例详见其说明书), 并充分轻轻地混匀,室温下静置5 min

              B:准备 target plasmid  包装载体plasmid

              pCMV8.9/ psPAX23.33ug  (注:10cm dish 的量)  

              PMD.G / pMD2.G1.67ug    (注:10cm dish 的量)

                  Target plasmid   5ug(注:这3个质粒都加在同一个EP管中)

                 六?#35013;?#30340;量是:

              pCMV8.9/ psPAX2   1ug  

                       PMD.G / pMD2.G    0.5ug

                  Target plasmid       1ug

              C:将上述准备的质粒混合液滴加到optimemFugene 9的混合液中 ,RT ,静置20min

              2、6-8h后对293T细胞换液,注意加液?#20445;?#19981;要吹起细胞(沿着皿壁,轻轻地?#26377;?#22521;液);37°细胞培养箱中继续培养48h-----随后同时做SW480细胞的铺板(见后)。 

              DAY3

              SW480细胞的铺板:目的细胞SW480,需要提前一天铺板至10cm dish中(10cm dish SW480细胞接种个数是1*106个,六?#35013;?#22823;约2—3*105个),以保证感染时的密度为30~40%同时准备一个对照组10cm dish细胞,不感染病毒(注:SW480细胞比较难消化,贴壁比较牢,得放在培养箱中消化4min)。第二天弃上清液。

              DAY4

              慢病毒液的收集:转染48h 后(此时293T长满),收集上清液于15ml 离心管中,3000rpm离心20min,将上清液用0.45um?#36865;?#36807;滤。再向10cm dish 10ml培液,24h之后,可以再次收集上清液,按照?#30475;?#29992;量分装,保存于-80°冰箱中。(如果病毒液暂时不用,可以置-80°冰箱中避光保存,千万不能反复冻融)。可以选择用浓缩管浓缩。

              慢病毒感染目的细胞SW480

              1、配置3ml 培养基1640 (10%FBS), 然后加入3ml 病毒上清液(剩余的病毒上清液放-80冰箱中保存), 24h之后补加4ml 1640培养液,为了保证细胞处于良好状态;

              2、10cm dish置于细胞培养箱中再培养24h-------(如果目的基因带有GFP?#26165;?/span>72h之后可以通过荧光显微镜看感染情况);


              3、48h后,弃上清,更换新鲜培养基6~8ml,并加入相应浓度药物筛选(G418或者嘌呤霉素); 

              4筛选2-3天之后,观察dish中细胞生长的状况,不感染病毒的对照组细胞应该全部死光,而感染病毒的细胞存活率?#32454;擼灰部?#36890;过观察GFP的亮度,判断筛选是否成功,随后用流式细胞仪进行分选。

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